تعیین جنسیت جوجه ها پیش از تفریخ بصورت اتوماتیك

چاپ

altرویای تعیین جنسیت  جوجه ها پیش از تفریخ كم كم تبدل به واقعیت می شود.در  مقاله ذیل اصول و روش های كاربردی ویژه ای شرح داده شده است
صنعت جوجه كشی جهان هر ساله میلیاردها جوجه یكروزه تولید می كندكه هر جو جه  پس از تفریخ تعیین جنسیت می شود. جوجه های نر از همان ابتدا به تدبیر انسان جدا شده و جوجه های ماده برای تولید تخم مرغ پرورش داده می شوند.

معدوم ساختن جوجه های نر باعث سلب حقوق حیوانات و صرف  كردن مباحث گوناگون حول محور ذكر شده در صنعت مرغداری می شود. با استفاده از فن آوری رو به رشد جاری می توان جوجه ها را پیش از تفریخ بصورت اتوماتیك تعیین جنسیت نمود و جنین های درون تخم ها را به جای قربانی كردن جوجه های یكروزه ، به شیوه أی معقول و مقبولِ عام معدوم ساخت. علاوه بر آن تعیین جنسیت جوجه ها بصورت خودكار باعث كاهش استرس ناشی از تعیین جنسیت دستی می شود كه نهایتا منتج به كاهش دورة انتظار جوجه ها شده و دسترسی سریع تر به آب و دان را میسر می سازد. اصول اولیه روش مذبور عبارت از تعیین استروژن در مایع آلانتوئیكِ موجود در تخمِ جنین های ماده است. ابزارهای اولیه ویژه ای برای نیل بدین مقصود ابداع شده اند كه به شرح ذیل میباشند:
•    ابزار اولیه جهت جمع آوری نمونه های مایع آلانتوئیك از تخم ها در آخرین مراحل رشد جنین
•    ابزار اولیه جهت تعیین میزان استروژن در نمونه های مایع آلانتوئیك
•    ابزار اولیه جهتِ دسته بندی و انجامِ واكسیناسیون تخمی  و در آخر انتقالِ تخم های تعیین جنسیت شده ابداع و تكمیل این نوع دستگاه ها در مقیاس تجاری در مرحله آزمایش است.
اصول تعیین جنسیت به روش دستی
اصول اولیه تعیین جنسیت به روش ژاپنی یا ركتال در سال 1920 میلادی پایه گذاری شد. با این روش ژاپنی ها در یافتند طی یكی دو روزِ ابتدای زندگی جوجه می توان از روی برجستگی ها ، خطوط  و چین های ركتوم پی به جنسیت جوجه برد (Jull,  19 34;  Masui &Hasimoto ,1933  ). تعیین جنسیت به روش ركتال تغریبا نوعی هنر است كه اغلب توسط آسیایی ها انجام می شود و مهارت و تمركز ویژه أی همچون تمركز زِن (Zen) را می طلبد ( Hoh,1997 ). به علت سرعت عمل بالای سِكسرها اغلب حدود 4/1%  تا 8/1%  وازدگی (اشتباه)و 5/0% تا 0/1% میزان مرگ و میر بالا می رود. آن ها معمولا كارگرهای قراردادی هستند و مدام از یك جوجه كشی به جوجه كشی دیگر می روند. آن ها در جوجه كشی اغلب ساعات كسل كننده أی را می گذرانند. آمد و شدِ این افراد بین جوجه كشی ها همواره صنعت مرغداری را در معرض انتقال بیماری ها بین مراكز تولید طیور قرار می دهد.
روش دیگر تعیین جنسیت استفاده از سرعت رشد پرها در جوجه های هم خون است كه عامل اصلی آن ژن K  است (Warren,1976 ) . در این روش با آزمایش طول نسبی پوشش اولیه و پرپوشِ بال در جوجه های یكروزه ای كه حامل ژن  K هستند جنسیت جوجه تعیین می گردد. در این روش همواره فرض بر آن است كه جوجه های مذكر ژن رشد كند پر و جوجه های ماده ژن رشد سریع پر را حمل می كنند. این روش نسبت به روش ژاپنی ارزان تر بوده ونیاز به نیروی كارٍ  ماهر نیز ندارد. اما ژنٍ K  كه سرعت رشد پرها را تعیین می كند با نوعی ویروسٍ اندوژن ( ویروسی از خانوادهء اونكورنا ـ مترجم ) (Bacon et al., 1988 ) ارتباط دارد. این ویروس باعث نوعی مقاومت ایمو نولوژیك (مصونیت) در برابر بیماری لوكوز لمفوئید (Crittenden et al., 1987) می شود و لذا در پرورش انبوه نوعی نقص محسوب می شود. برخی از نژادهای طیور نیز دارای رنگ های ویژه ای در پرهای خود هستند كه در هر جنس متفاوت می باشد اما این نژادها نیز به اندازه نژادهای دیگر دارای ارزش تجاری نیستند. لازم به ذكر است میزان خطای تعیین جنسیت بر اساس رنگ بیشتر از خطای روش تعیین جنسیت از روی سرعت رشد پر است.

 

 

اصول تعیین جنسیت به روش خودكار
استقبال از روش تعیین جنسیت جنین طیور بصورت خودكار منوط به كاركرد دستگاهی است كه دقتِ تمایز آن برای هر 20000 تا 30000 تخم در ساعت حدود 5/98% باشد. البته هزینه تمام شده نیز نباید بیش از هزینه تعیین جنسیت به صورت دستی باشد. تحقیقات پیشین عوامل فیزیولوژیك دیگری را اصول كار خود قرار داده بودند مانند : سرعت ضربان قلب (Laughlin et al .,1976 ;Glahn et al 1987 )، تمایز PCR  از روی كرومزوم W  ویژه در جنس ماده( Clinton ;1994;Uryu et al 1989;Petitte,1992 ) ، رزونانس هسته ای مغناطیسی برای تعیین تمایزات آناتومیك مثل اختلاف در غدد دو جنسِ نر و ماده(Vandenabeele, et al ,1993) ،و در نهایت سیر و روندِ سلول شناختیِ تخم به عنوان اصول اصلی و بالقوه تعیین جنسیت تخمِ طیور . اما اصول طرح شده در این مقاله شامل تعیین تركیبات مختص جنس در مایع جنینی تخمِ مرغ است( Gill et al ,.1983 ).
اساس تعیین جنسیت  دستگاهِ خودكار وجودِ تركیبات استروژنی در مایع آلانتوئیك جنینهای ماده و عدم وجود این تركیبات در مایع جنینی جنین های نر میباشد. پیشتر میزان استرادیول در مایع آلانتوئیك جنین های گوشتی 17 روزه به وسیله كیت  تجاری آن موسوم به كیت RIA (Diognostic Products,Los Angeles ,california ) اندازه گیری شده است.سطح استرادیول در مایع آلانتوئیك جنین های نر قابل یافت و اندازه گیری نیست و یا اگر یافت شود كمتر از Pg/mg 42 است. اما سطح استرادیول یافت شده در مایع الانتوئیك جنین های ماده چیزی حدود 830-113 Pg/mg می باشد كه دست كم سه بار بیشتر از مقدار یافت شده در جنین های نر است.طی تحقیقات به عمل آمده بر روی 490 نمونه مایع آلانتوئیك معلوم شد استروژن تركیب شیمیایی بی نظیری است كه به سادگی می توان به وسیله آن جنسیت جنین طیور را آشكار ساخت. استروژن موجود در مایع آلانتوئیك اغلب به صورت تركیبات “سولفات” یا” گلوكورونید” یافت می گردد. برای یافتن استروژن آزاد در مایع آلانتوئیك این مایع ابتدا باید با سولفاتاز یا گلوكورونیداز فراوری شود (تا استروژن از تركیبات دیگر جدا شود) . جنین مرغ را می توان بر اساس وجود تركیبات استروژنی در مایع آلانتوئیك جنین ماده در خلالِ روزهای 13 تا 18 زندگی جنین تعیین جنسیت كرد . لازم به ذكر است توجه به سن گله یا نژاد جوجه ها ضرورتی ندارد.
بررسی تحلیلی تركیبات استروژنی موجود در مایع آلانتوئیك  دستگاه خودكار تعیین جنسیت مجهز به یك سنسور زنده ( LifeSensors Inc.Malven PA ) جهت تشخیص تركیبات استروژن در مایع آلانتوئیك است. این سنسور زنده به لحاظ ژنتیك یك مخمر اصلاح شده است كه تولید و ترشح گیرنده استروژن انسانی برای آن تعریف شده است ، ژن حامل كه دارای عامل عنصر پاسخگوی به استروژن است با آنزیم.coli E-  B galactosidase جفت  گردیده است( Butt & Chen ,1999 ). این سلول مخمر همچنین قادر به تولید و ترشح آنزیم  E.coli glucuronidase است ، این آنزیم دارای قابلیت شكستن تركیبات “گلوكورونید – استروژن” است. استروژن به كمك آنزیم یاد شده از تركیب گلوكورونید – استروژنِ موجود در مایع جنینی جداسازی می شود. گلوكورونیدازمی تواند دارای منشاء ترشح از سنسور مخمر باشد و یا آنكه به محیط رشد مخمر افزوده شده باشد. گیرنده استروژن  در حضور استروژن با عناصر پاسخگو به استروژن تشكیل باند یا پیوند می دهد و نسخه برداری از ژن حامل را آغاز می كند. بدین ترتیب میزان غلظت استروژن در مایع آلانتوئیك با مقدار تحریك ژن حامل پیوستگی پیدا می كند. فعالیت محصول ژن حامل یعنی B_galactocidas با استفاده از سوبسترایی موسوم به O_Nitrophenil_beta-D_Galactopyranosidas  (ONPG ) اندازه گیری می شود . تركیب نهایی ماده أی زردرنگ است كه برای كالری متری یا اندازه گیری از روی رنگ مورد استفاده قرار می گیرد. سنسور زنده قادر است مقادیر پیكومولارِ هورمونِ تانیث یعنی استروژن را تشخیص دهد. سویهء اصلی این سنسور زنده یعنی مخمر (  Saccaromyces Cervasia )كاربرد فراوانی در صنعت پخت نان دارد.
سنسور حیرت انگیز ما قادر است تنها با استفاده از 4ul از مادهء آلانتوئیك , نر یا ماده بودن جنین را تشخیص دهد اما دستگاه خودكار تعیین جنسیت برای اطمینان از نتایج حاصله از  20ul  مایع جنینی استفاده می كند. نتیجهء كار سنسور  در آزمایشگاه 100% موفقیت آمیز بوده است.
نمونه برداری از مایع آلانتوئیك
مایع آلانتوئیك محیطِ ترشحی متابولیت های نیتروژنی جنین مرغ محسوب می شود (Romanoff, 1967 ).  مایع آلانتوئیك از حوالی روز پنجم زندگی جنین پدیدار می شود وتا سیزدهمین روز به حداكثر مقدارِ خود می رسد. با كم شدن رطوبت محیط و باز جذب آن حجم این مایع نیز كاهش می یابد اما تا روز هجدهم هنوز حجم قابل تمایزی (  mls 1تا 2 )از آن قابل تشخیص می باشد( Romanoff, 1967 ).
تنها موانع بینِ مایع آلانتوئیك و پوستهء تخم مرغ غشاء های داخلی و خارجی پوسته و غشا های كوریو آلانتوئیك هستند. هر چند كه مایع آلانتوئیك تمام محیطِ تخم مرغ واجدِ جنین را احاطه كرده است اما تجمع آن بیشتر در راس تخم مرغ درست زیرِ غشاءهایی است كه روی اتاقك هوایی قرار دارند. علت تجمع مایع آلانتوئیك در راس تخم مرغ بیشتر به خاطر نیروی جاذبه و جایگزینی جنین و كیسهء زرده در زیر است. به خاطر متغییر بودن حجم كیسهء هوایی بین تخم مرغ ها نمونه برداری از مایع آلانتوئیك در وضعیتِ ایستادهء تخم مرغ اغلب با مشكلاتی همراه است.
می توان از نیروی جاذبه برای راندنِ مایع آلانتوئیك به محل مناسب نمونه گیری استفاده كرد. اگر تخم مرغ را در محور طولی آن بخوابانیم ، مایع آلانتوئیك در راس درست زیرِ پوسته قرار می گیرد. بدین ترتیب با خواباندن تخم مرغ به پهلو كار نمونه برداری به میزان 20ul بسیار ساده خواهد شد و آزمونِ سنسور ما میسر می گردد. كمپانی Embrox یك نمونهء ابتدایی با یك خط تولید ابداع كرده است كه مایع آلانتوئیك را از تخمِ جوجه های گوشتی نمونه برداری می كند. با بهینه كردنِ فرایندِ نمونه برداری هنگام استقرار تخم مرغ در محور طولی در جزئیاتی چون عمق نمونه برداری ، نوع سوزن مورد استفاده ، میزان مكش ، و زاویهء استقرارِ تخم مرغ حدود 96% از تخم مرغ ها آزمایش خود را با موفقیت گذراندند. در نمونه های بعدی تجاری باید عملكرد دستگاه بهتر باشد. نمونة ابتدایی دستگاه خودكار تعیین جنسیت كمپانی  Embrex یك نمونهء تجاری ابتدایی با قابلیت 5000 هزار تخم مرغ در ساعت ابداع كرده است كه هم اكنون در حال سپری كردن آزمایش خود در یك سالنِ جوجه كشی است و سازندگان پیوسته برای بهینه شدن عملكردِ دستگاه در تلاشند. دستگاهِ  خودكارِ تعیین جنسیت شامل سه اتاقكِ مستقل از هم است كه به وسیلهء یك شبكه باهم ارتباط دارند.   اتاقك ِاول ، محفظه ای است كه از مایع آلانتوئیك نمونه برداری می كند. دسته أی از تخم مرغ ها طی روزهای 15 ، 16 یا هفدهمین روز از 21 روز دوره رشد جنین به صورت دستی ،طیِ چرخه ای جمع آوری می شوند و بر روی نقاله ای قرار می گیرند. سپس یك سنسورِ نوری به صورت اتوماتیك تخم مرغ های تمیز را تشخیص داده و  سپس تخم مرغ های كثیف به وسیلهء لوله های مكنده أی جدا شده ودر شانه هایی جداگانه قرار می گیرند. در مرحلهء بعد شانه های مذكور دوباره تخم مرغ ها را به جایگاهشان باز گردانده و متمركز می سازند. حال نوبت سوزن نمونه برداری است كه  درست در مركز، در عمق ویژه أی وارد هر تخم مرغ شده و 20ul مایع آلانتوئیك را نمونه برداری می كند .حال نمونه های مایعِ جمع آوری شده در شیارهای  ِیك قالب پلاستیكی با  باركد ترموفرم ( باركدِ ساخته شده به وسیلهء حرارت ) ریخته شده و ته نشین می گردند. هر قالب تقریبا دارای 2500 شیار است كه به همان  ترتیب همانندِ تخم مرغ ها قرارگرفته اند. سوزن ها در پیِ هر نمونه برداری از هر تخم مرغ تمیز می شوند. در مرحله بعدی تخم مرغ ها در شانه هایِ واجدِ باركد به صورت ایستاده دوباره قرار گرفته و مجدداً به محل سالن جوجه كشی بازگردانده می شوند. سپس قالب های آزمایش به صورت دستی در چرخ دستیِ قفسه  داری قرار می گیرند . حال نوبت كامپیوتر  شبكه  است كه باركدِ  شانه های تخم  مرغ را با قالب  های حاوی مایعِ آلانتوئیك تطابق دهد. اتاقكِ دوم یك نمونهء آزمایشگرِ خودكار است. به كمكِ یك اپراتور چرخدستی ِحاویِ قفسه های قالب ها واردِ دستگاهِ خودكارِ آزمایشگر می شود. قالبها به كمك یك سیستمِ انتقال دهنده زیرِ سُرنگ توزیع قرار می گیرند. در این بخش سرنگ توزیع به هر شیار 30ul مٌعرفِ ویژهء سنسورِ زنده اضافه می كند. افزودنِ معرف به شیارهای یك قالب 5 تا 6 دقیقه زمان نیاز دارد. سپس هر قالب به طور جداگانه به مدت 4 ساعت در یك محفظهء انكوباتور تحت شرایط تعریف شده قرار می گیرد. در مرحلهء بعد  سوبسترای  ONPG به طور اتوماتیك به هر  شیار  افزوده  می گردد ، پس از 30 دقیقه رنگ های مٌعرف   آشكار  می گردند. با ظهورِ رنگ ها یك دوربین CCD به دقت از هر شیار اسكن می گیرد و نر یا ماده بودنِ هر تخم مرغ تعیین می گردد. از اینجا به بعد كار  ساده است ، اطلاعات جمع آوری شده   با  شانه های تخم مرغ ها تطبیق  داده می شود  .  سپس  تمام  قالب های حاوی معرف آزمایش به صورت اتوماتیك جمع آوری شده و بر روی چرخدستی قرار می گیرند. در نهایت این قالب ها پیش از انهدام ضدعفونی می گردند تا سنسور زندهء موجود در آن ها به طور كامل از میان برود.
اتاقك سوم وظیفة دسته بندی تخم مرغ هارا بر اساس جنسیت  بر عهده دارد. همچنین در این بخش تخم مرغ های نر معدوم گشته و تخم مرغ های ماده نیز در ردیف هایی چیده- شده و  پس از واكسیناسیونِ درون تخمی روانهء سبدهای تفریخ می گردند. در حقیقت این شبكهء  كامل بر اساس باركد موجود بر روی شانه ها و اطلاعات  طبقه بندی  شده  جنسیت تخم مرغ ها را تعیین می كند. 
تاثیرات این روش بر تفریخ
آزمایشات بسیاری برای ارزیابی تاثیرات تعیین جنسیت به روش یاد شده در حال انجام است. در این روش ناگزیریم طی روزهای 15 ،16 یا هفدهمِ رشد جنین ابتدا یك سوراخ در پهلوی تخم مرغ و سپس در روزهای 18 یا نوزدهم سوراخ دیگری در راس تخم مرغ برای انجام واكسیناسیون ایجاد كنیم. تا كنون آزمایشات بسیاری برای تعیین تاثیرات این روش بر تفریخ تخم صورت گرفته است.
در تحقیقات اولیه تاثیر ایزوله یا قرنطینه بودنِ محل نمونه برداری  بر میزان تفریخ ارزیابی شده است. طی این آزمایش تخمِ ،  مرغ های گوشتی  در روز شانزدهمِ انكوباسیون به صورت دستی سوراخ شدند سپس به دستگاه های ستر بازگردانده شده و مجددا در روز نوزدهمِ انكوباسیون به صورت درون تخمی واكسینه شدند. پس از انجام دو آزمایش مشخص شد ایجاد  سوراخ  در  پوستهء  تخم مرغ در روز شانزدهم  موجب  كاهش تفریخ  به  میزان 2 %  می شود(جدول 1 ). حتی به كار بردن تدابیر ویژهء قرنطینه نیز كاهشِ تفریخ را تعدیل نكرد.

 


جدول 1-تاثیر تدابیر قرنطینه بر میزان تفریخ در  تعیین جنسیت به صورت خودكار

 

تیمار

آزمون اول

%زنده تفریخ شده

آزمون دوم

%زنده تفریخ شده

میانگین

جمع كل

شاهد

A 8/95

0/96

9 /95

(36)5145

سوراخ شده

B7/93

3/94

0 /94

(36)5145

سوراخ و قرنطینه

B1/94

8/93

0/94

(36)5145

حروف A   و B اختلاف معنی داری معادل ( p<.05 ) است.

در آزمایشات بعدی تاثیر ضدعفونی كردن جایگاه برمیزان تفریخ  پیش از سوراخ كردن و نمونه برداری  از تخم مرغ ها  ارزیابی  شد . آزمایشات  از تاثیر  مثبت  ضدعفونی  پیش از نمونه برداری خبر  دادند .در این روش آثار منفی سوراخ كردنِ پوسته  در روزِ شانزدهمِ انكوباسیون تا حدودی جبران می شد (جدول 2).در سال 2002 میلادی  تعیین جنسیت به وسیلهء دستگاه های ابداعی اولیه و تاثیر آن ها بر میزان تفریخ ارزیابی گردید.


جدول2- تاثیر ضدعفونی جایگاه برمیزان تفریخ پیش از نمونه برداری

تیمار

%زنده تفریخ شده

جمع كل تخم مرغ ها

شاهد

A 96/6

(42)5670

سوراخ شده

B 95/7

(42)5670

ضدعفونی و سوراخ كردن

A 96/7

(42)5670

 

نتیجه
كمپانی Embrx  در نهایت امكانپذیر بودنِ اصول این روش را در سالن های جوجه كشی آینده روشن خواهد ساخت. مشكلاتِ جدی این روش شاملِ مواردِ ذیل است:
امكان نمونه برداری با درصد بالا از هر تخم مرغی بدون توجه به شكل واندازهء آن البته باید تاثیرات منفی این روش بر میزان تفریخ و بر عملكرد  آتی جوجه در فارم های تجاری اندك باشد.فراهم آوردن نیروی كارِ ماشینی كافی و قابل اطمینان به وسیلهء دستگاه ه های ابداعی ودر نهایت عملكرد دقیق و صحیحِ سنسور زنده در محیطِ جوجه كشی ها با از میان رفتن موانع یاد شده كمپانی Embrex در آینده دستگاه هایی با قابلیت فراوری 20000 تا 30000 تخم مرغ در ساعت خواهد ساخت. در صورت موفقیت آمیز بودن این روش تا حدودی از بحث های مربوط به حقوق حیوانات در خصوص معدوم كردن جوجه های نر كاسته خواهد شد و جنجال كمتری خواهیم داشت